Zvieratá, ktoré dávajú nádej

Zvieratá, ktoré dávajú nádej

Oleg Makarov
"Populárna mechanika" № 4, 2016

Jedna z najhorších chorôb, ktoré príroda poskytuje ľuďom, je genetická. Môžete úspešne zvládnuť príčinné ochorenia – baktérie a vírusy, ale ak je problém v ľudskom genóme od narodenia, je mimoriadne ťažké pomôcť pacientovi. Moderná veda tvrdošíjne hľadá príležitosť na "opravu" mutovaných génov.

Duchenne myodystrofia je jednou z častých, ale stále relatívne bežných genetických ochorení. Choroba je diagnostikovaná vo veku od troch do piatich rokov, zvyčajne u chlapcov, prejavujúca sa najskôr iba v prekážajúcich pohyboch, v desiatich rokoch trpiacich takouto myodystrofiou už nemôže chodiť, 20-22 rokov sa končí jeho život. Je spôsobená mutáciou génu dystrofínu, ktorý je na X chromozóme. Kóduje proteín, ktorý spája membránu svalovej bunky s kontraktilnými vláknami. Funkčne je to druh pružiny, ktorý zaisťuje hladkú redukciu a integritu bunkovej membrány. Mutácie v géne vedú k dystrofii kostrového svalového tkaniva, membrány a srdca. Liečba ochorenia je paliatívna a umožňuje lenuvoľniť nejaké utrpenie. Avšak s vývojom genetického inžinierstva sa na konci tunela objavilo svetlo.

O vojne a pokoji

Génová terapia je dodávanie konštrukcií na báze nukleových kyselín do buniek na liečbu genetických ochorení. Pomocou tejto terapie môžete opraviť genetický problém na úrovni DNA a RNA, čím sa mení proces expresie požadovaného proteínu. Napríklad DNA môže byť dodaná do bunky s korigovanou sekvenciou, s ktorou je syntetizovaný funkčný proteín. Alebo naopak, sú možné delécie určitých genetických sekvencií, ktoré tiež pomôžu znížiť škodlivé účinky mutácie. Teoreticky je to jednoduché, ale v praxi je génová terapia založená na najkomplexnejších technológiách pre prácu s predmetmi mikrosvety a je kombináciou pokročilého know-how v oblasti molekulárnej biológie.

"Gén dystrofínu, ktorého mutácie produkujú Duchenne myodystrofiu, je obrovský," hovorí vývojový riaditeľ biotechnologickej spoločnosti Marlin Biotech, Ph.D., v biológii Vadim Zhernovkov. "Obsahuje 2,5 milióna párov báz, ktoré možno porovnať s počtom písmen v románe "Vojna a pokoj".Predstavme si, že sme vytiahli z epickej stránky niektoré dôležité stránky. Ak sú na týchto stránkach opísané významné udalosti, pochopenie knihy by bolo už ťažké. Ale gén je komplikovanejší. Hľadanie inej kópie vojny a mieru je jednoduché a chýbajúce stránky je možné čítať. Ale gén dystrofínu je v chromozóme X a u mužov je sám. Takže v pohlavných chromozómoch u chlapcov je pri narodení uložená iba jedna kópia génu. Nič nie je nič iné.

Napokon pri syntéze proteínu z RNA je dôležité zachovať čítací rámec. Čítací rámec určuje, ktorá skupina troch nukleotidov sa číta ako kodón, ktorý zodpovedá jednej aminokyseline v proteíne. Ak existuje v géne delécia fragmentu DNA, ktorý nie je násobkom troch nukleotidov, nastane posun čítania – kódovanie sa zmení. Toto by bolo možné porovnať so situáciou, keď po roztrhnutých stránkach v celej zostávajúcej knihe budú všetky písmená nahradené ďalšími písmenami v abecednom poradí. Získajte bezvýznamnosť. To je tá istá vec s nesprávne syntetizovaným proteínom. "

Biomolekulová náplasť

Jednou z účinných metód génovej terapie na obnovenie normálnej syntézy proteínov je preskočenie exónov pomocou krátkych nukleotidových sekvencií.V technológii Marlin Biotech bola pomocou tejto metódy už vyvinutá technológia práce s génom dystrofínu. Ako je známe, v procese transkripcie (syntéza RNA) sa najskôr vytvorí tzv. Prematrixová RNA, obsahujúca obidve oblasti kódujúce proteíny (exóny) a nekódujúce (intróny). Ďalej začína proces spájania, počas ktorého sú oddelené intróny a exóny a vzniká "zrelá" RNA pozostávajúca iba z exónov. V tomto bode môžu byť niektoré exóny blokované, "zakryté" pomocou špeciálnych molekúl. Výsledkom toho je, že v zrelej RNA nebudú existovať tie oblasti kódovania, ktoré by sme sa radšej zbavili, a tým sa obnoví čítací rámec, proteín sa syntetizuje.

"Táto technológia sme debugovali. in vitro, – Vadim Zhernovkov hovorí, – to znamená, na bunkových kultúrach pestovaných z buniek pacientov s Duchenne myodystrofiou. Ale jednotlivé bunky nie sú organizmom. Pri invázii bunkových procesov musíme pozorovať účinky naživo, ale nie je možné zapojiť ľudí do testovania z rôznych dôvodov, od etického až po organizačné. Preto bolo nevyhnutné získať model Duchenovej myodystrofie s určitými mutáciami založenými na laboratórnom zvierati. "

Ako pichať mikrosvet

Transgénne myši umožňujú vytvárať živé modely ťažkých ľudských genetických ochorení. Ľudia by mali byť vďační týmto maličkým tvorom.

Transgénne zvieratá sú zvieratá získané v laboratóriu, v genóme, ktorého zmeny boli zámerne a zámerne vykonané. Späť v 70-tych rokoch minulého storočia bolo jasné, že tvorba transgénov je najdôležitejšou metódou pre štúdium funkcií génov a bielkovín. Jednou z najčastejších metód na získanie úplne geneticky modifikovaného organizmu bola injekcia DNA do prejdúka ("prekurzor jadra") zygotov oplodnených vajíčok. To je logické, pretože je najjednoduchšie modifikovať genóm zvieraťa na samom začiatku jeho vývoja.

Klenotníci žiarli. Injekcia DNA do pronukleózneho zygotu je jednou z najčastejších a najtradičnejších transgénnych technológií. Injekcia sa vykonáva manuálne použitím ultrajemných ihiel pod mikroskopom s 400-násobným zväčšením

Injekcia do jadra zygote je veľmi netriviálnym postupom, pretože ide o mikroštruktúry. Vajcovitá bunka myši má priemer 100 μm a pronukleus je 20 μm. Operácia prebieha pod mikroskopom s 400-násobným zväčšením, ale injekcia je najviac manuálna práca.Samozrejme, pre "injekciu" sa nepoužíva tradičná striekačka, ale špeciálna sklenená ihla s vnútorným dutým kanálom, kde sa zhromažďuje génový materiál. Jeden koniec môže byť držaný v ruke a ten druhý – veľmi tenký a ostrý – je prakticky neviditeľný voľným okom. Takáto krehká konštrukcia borosilikátového skla samozrejme nemôže byť dlhodobo skladovaná, preto je k dispozícii laboratórium, ktoré je na pracovisku vystavené na špeciálnom stroji tesne pred prácou. Používa sa špeciálny systém kontrastného zobrazovania bunky bez farbenia – interferencia s samotným pronukleom je traumatická a je rizikovým faktorom pre prežitie buniek. Farba by bola ďalším takým faktorom. Našťastie sú vajíčka pomerne húževnaté, ale počet zygotov, ktoré spôsobujú transgénne živočíchy, tvorí iba niekoľko percent celkového počtu vajíčok, v ktorých bola injekcia DNA uskutočnená.

Ďalšia fáza je chirurgická. Prebieha operácia na transplantáciu mikroinjekovaných zygotov do lúpea vajíčka recipientnej myši, ktorá sa stane náhradnou matkou budúceho transgénu.Potom laboratórne zviera prechádza cez tehotenský cyklus prirodzeným spôsobom a narodia sa potomstvá. Zvyčajne vo vrhu je asi 20% transgénnych myší, čo tiež naznačuje nedokonalosť metódy, pretože obsahuje veľký náhodný prvok. Pri injekcii výskumník nemôže kontrolovať, ako presne vložené fragmenty DNA budú integrovať do genómu budúceho organizmu. Existuje vysoká pravdepodobnosť takýchto kombinácií, ktoré povedú k smrti zvieraťa v embryonálnej fáze. Napriek tomu metóda funguje a je celkom vhodná na množstvo vedeckých účelov.

DNA nožnice

Existuje však efektívnejšia cesta založená na cielenom editovaní genomu pomocou technológie CRISPR / Cas9. "Dnes molekulárna biológia je trochu podobná dobe vzdialených námorných expedícií pod plachtou," hovorí Vadim Zhernovkov. "Takmer každý rok sa v tejto vede vyskytujú významné objavy, ktoré môžu zmeniť náš život.Napríklad pred niekoľkými rokmi objavili mikrobiológovia , bakteriálny druh, ktorý je predmetom štúdia, je imúnny voči vírusovým infekciám.V dôsledku ďalšieho výskumu sa ukázalo, že bakteriálna DNA obsahuje špecifické lokusy (CRISPR)z ktorých sa syntetizujú fragmenty RNA, ktoré sa môžu komplementárne viazať na nukleové kyseliny cudzích prvkov, napríklad DNA alebo RNA vírusov. Proteín Cas9, enzýmová nukleáza, sa viaže na túto RNA. RNA slúži ako vodidlo Cas9, ktoré označuje špecifickú oblasť DNA, v ktorej nukleáza robí rez. Asi pred troma až piatimi rokmi sa objavili prvé vedecké práce, v ktorých bola vyvinutá technológia CRISPR / Cas9 na úpravu genómu. "

Proteín-fréza. Diagram zobrazuje proces CRISPR / Cas9, ktorý zahŕňa subgenómovú RNA (sgRNA), jej časť pôsobí ako RNA sprievodca, rovnako ako Cas9 proteínová nukleáza, ktorá rezy oboma vláknami genómovej DNA na indikovanej RNA sprievodcovi.

V porovnaní so spôsobom zavedenia konštruktu na náhodné vloženie umožňuje nová metóda vybrať prvky systému CRISPR / Cas9 takým spôsobom, aby presne smerovali RNA vodidlá do správnych častí genómu a dosiahli cielené odstránenie alebo vloženie požadovanej DNA sekvencie. Chyby sú tiež možné v tejto metóde (RNA sprievodca niekedy nie je pripojený k regiónu, na ktorý je určený), avšak pomocou CRISPR / Cas9 je účinnosť tvorby transgénov už okolo 80%."Táto metóda má široké vyhliadky, a to nielen pri tvorbe transgénov, ale aj v iných oblastiach, najmä v oblasti génovej terapie," hovorí Vadim Zhernovkov. "Technológia je však len na začiatku a predstavte si, že v blízkej budúcnosti je potrebné opraviť gén kód ľudí bude s CRISPR / Cas9 dosť ťažký. Pokiaľ existuje možnosť chyby, existuje nebezpečenstvo, že človek stratí nejakú dôležitú kódovaciu časť genómu. "

Mlieko

Vývoj transgénnych technológií umožňuje výrobu živočíšnych bielkovín požadovaných farmaceutickým priemyslom. Tieto proteíny sa extrahujú z mlieka transgénnych kôz a kráv. Existujú tiež technológie na získanie špecifických proteínov z kuracích vajec.

Ruská spoločnosť Marlene Biotech dokázala vytvoriť transgénnu myš, v ktorej bola mutácia vedúca k Duchenovej myodystrofii úplne reprodukovaná a ďalším krokom by bolo testovanie technológií génovej terapie. Súčasne nie je vytvorenie modelov ľudských genetických chorôb založených na laboratórnych zvieratách jediným možným použitím transgénov. Preto v Rusku a západných laboratóriách prebieha práca v oblasti biotechnológie, ktorá umožňuje získať liečivé bielkoviny živočíšneho pôvodu dôležité pre farmaceutický priemysel.Ako výrobcovia môžu byť použité kravy alebo kozy, v ktorých sa môže meniť bunkový aparát na výrobu bielkovín obsiahnutých v mlieku. Liečivý proteín sa môže extrahovať z mlieka, ktoré sa získava nie chemickými prostriedkami, ale použitím prirodzeného mechanizmu, ktorý zvýši účinnosť lieku. V súčasnosti sú vyvinuté technológie na výrobu takýchto liečivých proteínov ako ľudský laktoferín, prourokináza, lyzozým, atrin, antitrombín a iné.


Like this post? Please share to your friends:
Pridaj komentár

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: